前　言

　　由病毒、細菌或其他病原微生物為起始材料，經(jīng)培養(yǎng)增殖等制成的減毒、滅活的病原體，或再經(jīng)分離、提取等方法制備的富含免疫原性組份（亞單位），免疫機體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答而達到預(yù)防某種疾病的產(chǎn)品，為預(yù)防用疫苗。

　　本指導(dǎo)原則僅適用于采用傳統(tǒng)方法（滅活、減毒、分離提?。┲苽涞念A(yù)防用疫苗，目的是為該類制品的臨床前研究提供應(yīng)遵循的原則。

　　一、基本原則

　?。ㄒ唬?yīng)符合國家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的要求；

　?。ǘ?yīng)對所預(yù)防的疾病的流行情況進行分析，包括疾病的危害程度，所涉及的人群特點，病原體的分型及流行趨勢等；

　　（三）應(yīng)對疫苗的有效性、安全性及必要性進行分析；

　?。ㄋ模┰u估疫苗接種的風(fēng)險與效益，并提出擬采取避免或減少其危害性或不良反應(yīng)的措施。

　　二、用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種

　　疫苗生產(chǎn)用菌毒種必須證明為引起相應(yīng)疾病的細菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，應(yīng)明確提供以下信息：

　?。ㄒ唬┚局昝Q及來源

　　1.菌毒株名稱。

　　2.菌毒株來源：

　　（1）菌毒株來源的宿主一般情況。

　?。?）發(fā)病地點、發(fā)病日期；臨床確診疾病名稱及日期、實驗室確診的主要依據(jù)、檢測項目、結(jié)果及日期；病人病程及轉(zhuǎn)歸。

　　3.菌毒株分離樣本來源：咽拭子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、組織標(biāo)本。取樣日期；取樣時病人的病期。應(yīng)提供病人治療期間使用的主要藥物包括抗生素、抗病毒藥物的劑量和療程等資料。鑒于人類的血液、腦脊液等在同一時間內(nèi)相對較少感染多種病毒或細菌，因此用病人血液等分離的菌、毒株較適宜用于疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)。

　　其他來源分離的菌、毒株的自然樣本參照上述要求提供相應(yīng)資料。

　?。ǘ┚⒍局攴蛛x過程

　　1.病毒分離用細胞名稱、代次、來源應(yīng)清楚，應(yīng)進行無菌、支原體和外源因子等檢測；病毒分離不得使用腫瘤原性的細胞系，應(yīng)使用非腫瘤原性細胞，如原代細胞、人二倍體細胞或Vero細胞等。

　　2.病毒分離用動物名稱、品系、級別、年齡、接種途徑、飼養(yǎng)條件和制備毒種的動物臟器名稱等需詳細記載；如再適應(yīng)到細胞，應(yīng)參照上述對病毒分離用細胞的要求。

　　3.菌毒株分離用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條件需確定。

　?。ㄈ┚⒍局攴蛛x傳代特性

　　應(yīng)包括樣品處理方法、確證菌毒株首次陽性的代次、菌毒株檢定方法、每代培養(yǎng)條件、滴度、滴定方法、動物是否發(fā)病或死亡等資料。

　?。ㄋ模┚痉N庫的建立和保存

　　原始種子批是指已適應(yīng)到可生產(chǎn)疫苗的細胞或培養(yǎng)基，可穩(wěn)定傳代、具有良好的免疫原性、并經(jīng)過檢定可用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種。應(yīng)提供原始菌毒種代次、滴度，添加的保護劑的名稱和濃度、存儲條件等資料。種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》“生物制品制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求，應(yīng)對種子批進行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始菌毒種的一致性。

　　1.應(yīng)提供候選菌毒種研究資料

　　在建立原始菌毒種庫前應(yīng)考慮候選菌毒種的研究：包括收集不同地區(qū)的（不同地域、發(fā)病率和民族）、不同時期的（近年與往年）、不同年齡和性別、疾病不同癥狀或嚴(yán)重程度、不同樣本采集方式或來源（如血液、腦脊液、咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等）的至少10個以上菌毒株進行生物學(xué)等研究和比較，分析其異同點，為建立菌毒種庫提供依據(jù)。

　　2.三級種子庫建立的研究資料

　　選擇由多個候選菌毒種篩選獲得的有代表性的2-3株菌毒種，用適宜的方法進行毒株的純化，如空斑形成試驗，挑取遺傳穩(wěn)定性與原始種子一致的，至少在主要保護區(qū)域核苷酸及氨基酸序列一致的毒株。同時進行三級種子批建立和工藝適應(yīng)性、免疫原性和免疫效果比較研究。分析在種子批建立傳代過程中不同菌毒種的遺傳穩(wěn)定性、病毒滴度及免疫原性資料；比對不同菌毒種對發(fā)酵、培養(yǎng)、收獲、純化等生產(chǎn)工藝和滅活工藝的適應(yīng)性；考核不同菌毒種的免疫原性和免疫效果；對不同菌毒種的交叉保護水平和能力進行比較研究，確定交叉保護范圍廣、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答能力強的毒株。通過以上研究結(jié)合疫苗配方探討，綜合判斷、確定應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)的最佳菌毒株。

　　原始種子、主種子、工作種子及疫苗代次的毒株遺傳穩(wěn)定性應(yīng)保持一致。

　?。ㄎ澹┚痉N的檢定

　　1.鑒別試驗：可采用血清學(xué)、生物學(xué)、核酸序列分析等方法證明為該菌毒種。明確該病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對該種基因型或血清型的流行情況進行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護性進行分析和研究。對某些病原體，即使菌毒株為同一基因型或同一血清型，也應(yīng)對不同菌毒株的抗原性、免疫原性以及交叉保護能力進行比較。

　　2.純菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的要求進行，應(yīng)符合規(guī)定。

　　3.外源因子檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求進行，應(yīng)符合規(guī)定。

　　4.感染性滴度：應(yīng)能達到按生產(chǎn)工藝要求順利生產(chǎn)合格疫苗的要求。應(yīng)建立測定菌毒種感染性滴度的方法和標(biāo)準(zhǔn)，并提供這些感染性滴度與疫苗有效性之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)。

　　5.免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標(biāo)，應(yīng)制定和建立測定菌毒種免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，以評估該候選菌毒種能否進行疫苗生產(chǎn)。

　　6.減毒特性

　?。?）如研制減毒活疫苗應(yīng)對原始菌毒株的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性進行研究；應(yīng)提供減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒后的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性及減毒穩(wěn)定性資料，并進行減毒前后的特性對比，尤其要對減毒后的安全性和免疫原性做出確切的結(jié)論。

　?。?）應(yīng)建立減毒特性指標(biāo)的驗證方法、醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理動物模型和減毒后安全性的標(biāo)準(zhǔn)以及檢測方法和警戒毒力回復(fù)的依據(jù)等。

　　（3）注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測外，還應(yīng)驗證無逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。該驗證方法可采用PERT法等。

　　（4）如已知該病毒具有嗜神經(jīng)毒性，其驗證要求可參考《IABSS cientificworkshoponneurovirulencetestforlivevirusvaccines，WHO，31January2005》。

　　三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究

　?。ㄒ唬┥a(chǎn)用菌毒種批的遺傳穩(wěn)定性分析

　　確定工作種子批和疫苗代次的菌毒株主要保護區(qū)域核苷酸及氨基酸序列在傳代過程中發(fā)生改變的頻率。生產(chǎn)用菌毒種、細胞和涉及生產(chǎn)的工藝技術(shù)應(yīng)注意專利，應(yīng)進行相關(guān)專利查詢。

　?。ǘ┥a(chǎn)用細胞和/或培養(yǎng)基

　　1.生產(chǎn)用細胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的要求，除原代細胞外，采用其他細胞系應(yīng)建立細胞庫。

　　2.生產(chǎn)用培養(yǎng)基盡可能避免使用動物來源和可能引起人體不良反應(yīng)的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性原材料。

　?。ㄈ┮呙缟a(chǎn)工藝的研究

　　生產(chǎn)工藝需進行驗證。對疫苗生產(chǎn)中菌毒種代次、菌毒種接種量、收獲次數(shù)、滅活工藝及驗證、半成品配制、分批等要求，應(yīng)按現(xiàn)行版《中國藥典》執(zhí)行。

　　1.原液生產(chǎn)的主要技術(shù)參數(shù)的確定

　　（1）病毒與細胞的接種比例或者MOI的最佳參數(shù)、細胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時間和收獲時間等條件。菌毒種的接種量、培養(yǎng)和發(fā)酵條件等技術(shù)參數(shù)。

　?。?）滅活劑的選擇和依據(jù)。

　?。?）滅活、裂解、減毒或脫毒效果的驗證。效果驗證的依據(jù)、方法，應(yīng)采用盡可能敏感的細胞或培養(yǎng)基和方法進行。

　?。?）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：應(yīng)對純化和提取工藝中各種條件進行優(yōu)化，確定純化和提取工藝對抗原活性成分是否影響；應(yīng)建立穩(wěn)定的純化工藝，包括純化時的回收率、抗原活性和純度等的穩(wěn)定性，并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)和檢測方法。

　?。?）初步確定起始投料、原液、半成品和成品的產(chǎn)出比的數(shù)據(jù)。

　　2.對佐劑的要求

　　新型疫苗應(yīng)用的佐劑包括3類：分別為目前常用的鋁佐劑；批準(zhǔn)用于某些疫苗的佐劑如MF59等；新開發(fā)研制尚未用于疫苗特別是預(yù)防性疫苗的佐劑如CpG等。一般情況下，抗原量及免疫原性能滿足免疫保護的需要，則不使用佐劑為宜。

　?。?）是否選擇鋁佐劑，應(yīng)根據(jù)疫苗抗原的免疫原性、抗原與佐劑最優(yōu)配比等綜合考慮。應(yīng)注意不同種類抗原與鋁佐劑制備疫苗后，鋁佐劑對抗原的免疫增強作用可能有所差異，甚至不同制備批的鋁佐劑之間也有不同。

　?。?）對其他已經(jīng)批準(zhǔn)用于上市疫苗的佐劑，只需提供該類制劑的組分或化學(xué)組成，國內(nèi)外使用該類制劑的情況，無需對該佐劑再單獨進行毒理和安全性研究，但應(yīng)對疫苗成品進行嚴(yán)格的安全性研究，醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理獲得新型疫苗中佐劑的安全性資料。

　?。?）若國內(nèi)外均未使用過該類佐劑，則必須對其作用原理、安全性及佐劑效應(yīng)進行詳細的研究并建立切實可行的評價方法。

　?。ㄋ模┮呙绲呐浞窖芯?/p>

　　應(yīng)對疫苗的配方進行研究，如疫苗中添加的穩(wěn)定劑、緩沖液、以及賦形劑等是否對疫苗的免疫原性和安全性造成影響。

　　四、藥理、毒理和生物分布

　　疫苗不同于一般的化學(xué)藥品，藥理、毒理的試驗要求具有特殊性。由于各項藥理、毒理試驗是互相關(guān)聯(lián)的，因此在試驗和評價時應(yīng)綜合考慮相關(guān)的因素。

　　藥理學(xué)試驗主要包括疫苗的作用機理和免疫原性。應(yīng)建立適當(dāng)?shù)脑囼灧椒ㄔu價疫苗的免疫原性。如果有動物模型或可建立動物模型，可以采用動物模型直接評價疫苗的免疫原性。對一些有動物模型的感染性疾病，可以采用病原體的攻擊試驗評價該疫苗的保護效果。若無法建立動物模型，應(yīng)建立能驗證該疫苗有效性的體外試驗進行評價。應(yīng)考察接種的劑量與免疫原性的關(guān)系，通過試驗優(yōu)化免疫程序和接種途徑。

　　疫苗的動物長期毒性試驗及毒理學(xué)試驗應(yīng)選用相關(guān)種屬或品系的動物進行，至少選擇一種相關(guān)動物進行毒性試驗。試驗內(nèi)容主要包括重復(fù)給藥毒性試驗、急性毒性試驗、局部刺激性試驗等，必要時還應(yīng)包括生殖毒性試驗。接種劑量原則上應(yīng)使疫苗在動物體內(nèi)達到最佳的免疫應(yīng)答。疫苗的動物長期毒性試驗不需要每日給藥，接種次數(shù)建議至少比臨床擬定的接種次數(shù)多1次，一般采取2～3周的暴露間隔。試驗應(yīng)考察接種部位和全身的病理反應(yīng)，應(yīng)盡可能進行疫苗的免疫原性試驗，包括血清中和抗體效價或其它與免疫應(yīng)答有關(guān)的研究，重點考察疫苗誘導(dǎo)的免疫毒性作用，需關(guān)注對疫苗誘導(dǎo)的保護性細胞因子和與毒性有關(guān)的炎癥因子的檢測和分析。

　　疫苗通常不需要進行藥代動力學(xué)研究。必要時，應(yīng)建立敏感的動物模型考察減毒活疫苗的生物分布，測定接種疫苗后的病毒血癥（或菌血癥）以及持續(xù)時間、排毒（菌）方式和途徑，對是否呈現(xiàn)體內(nèi)復(fù)制及器官組織的感染應(yīng)進行研究。

　　五、質(zhì)量控制要求

　　在生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟中的產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝的進行，保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的穩(wěn)定性。應(yīng)在研發(fā)階段建立疫苗的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和參考品，應(yīng)建立并驗證純度、雜質(zhì)殘留、抗原、抗體、生物效力的定量檢測方法；單劑疫苗不應(yīng)添加含汞防腐劑。疫苗生產(chǎn)在培養(yǎng)階段不得添加抗生素。對種子培養(yǎng)階段添加抗生素的應(yīng)按現(xiàn)行版《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

　　1.工作種子批毒種制備階段應(yīng)重點關(guān)注其遺傳穩(wěn)定性，建立鑒別試驗、病毒滴度檢查、毒株免疫原性試驗的方法和標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.對純化工藝應(yīng)重點關(guān)注其純化產(chǎn)物、原液的抗原純度，建立用于評價純化產(chǎn)物所含有效成分的最低限量和雜質(zhì)的最高限量方法，通?？蓽y定有效抗原在疫苗中的絕對值或測定主要雜質(zhì)的量推算有效抗原在疫苗中的相對值。采用人二倍體細胞以外的細胞生產(chǎn)的，應(yīng)建立用于評價純化產(chǎn)物、原液中宿主細胞DNA和蛋白殘留量的方法。對生產(chǎn)過程中使用滅活劑的疫苗，應(yīng)建立有效的滅活方法，對滅活效果進行驗證；建立用于評價純化產(chǎn)物、醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理原液、成品中滅活劑殘留量檢測的方法。建立上述檢測方法時應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，并按藥典中有關(guān)方法學(xué)驗證指南對方法、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性和特異性等進行驗證，并制定相應(yīng)的限量范圍，以達到控制生產(chǎn)批間的一致性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的目的。

　　3.申報疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不得低于現(xiàn)行版《中國藥典》和WHO相關(guān)指南的要求。對于能夠定量檢測的安全性、有效性的指標(biāo)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)根據(jù)多批（有統(tǒng)計學(xué)意義的）產(chǎn)品，多次測定的試驗數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后擬定，計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)綜合考慮方法學(xué)的變異情況，確定合理的上下限要求，一般均值加減不得高于2.58個標(biāo)準(zhǔn)差作為上下限。

　　4.在半成品和成品階段的質(zhì)量控制至少包括：

　?。?）鑒別試驗、裝量。

　　（2）化學(xué)指標(biāo)：pH值，佐劑、滅活劑以及其他殘留有機溶劑。

　?。?）無菌檢查、異常毒性、熱原或細菌內(nèi)毒素檢查。

　?。?）生物效價：應(yīng)建立體內(nèi)或體外檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)。體內(nèi)效力試驗一般采用小鼠ED50的方法。由于用于預(yù)防的疫苗是通過機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生作用的，因此應(yīng)評價其體液免疫和細胞免疫水平。在評價體液免疫效價時，應(yīng)選擇實驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的檢測方法，并對該類方法進行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當(dāng)建立評價抗體質(zhì)量的方法，對抗體的性質(zhì)進行評價，如亞型測定及抗原中和位點分析等；在評價細胞免疫效價時，可建立檢測評價細胞免疫的方法（如Elispot方法等），也可通過對細胞因子的定量檢測評價其細胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項目，方法應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。若有動物模型，可進行動物保護性試驗。

　?。?）抗生素：按現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求執(zhí)行。

　　5.疫苗標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的研究：應(yīng)在疫苗研發(fā)階段考慮研究、建立穩(wěn)定工藝后的疫苗抗原參考品，以及疫苗效力、免疫原性檢測的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品。疫苗抗原參考品與其后生產(chǎn)多批次疫苗的質(zhì)量控制指標(biāo)的比對，可了解在上市后生產(chǎn)的疫苗抗原較研發(fā)階段的抗原在質(zhì)量上有無改變。疫苗效力、免疫原性檢測的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品可用于疫苗效力指標(biāo)的質(zhì)量控制。

　　六、穩(wěn)定性試驗

　　穩(wěn)定性試驗是指疫苗在規(guī)定保存溫度下的穩(wěn)定性試驗。由于穩(wěn)定性試驗的結(jié)果直接與制品的效期有關(guān)，且試驗觀察時間較長，因此應(yīng)在生產(chǎn)工藝確定后盡早留樣進行，定期取樣測定制品效力和其他相關(guān)的質(zhì)量指標(biāo)。對穩(wěn)定性試驗結(jié)果與加速穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)進行分析對比，可為正式產(chǎn)品的有效期確定提供依據(jù)。

　　七、疫苗劑量和免疫程序的研究

　　應(yīng)依據(jù)動物試驗中不同接種劑量、不同劑次的抗體陽性率醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理、應(yīng)答水平等免疫原性指標(biāo)，結(jié)合疫苗目標(biāo)人群感染前后、一般健康人群的抗體陽性率和水平等流行病學(xué)資料，綜合擬定疫苗申報臨床的劑量和程序。

　　八、臨床研究用樣品要求

　?。ㄒ唬┥暾埮R床試驗用的疫苗和對照品，按照國家GMP的要求，在符合現(xiàn)行中國藥品GMP的條件下生產(chǎn)；

　?。ǘ┡R床試驗用疫苗樣品應(yīng)與臨床前研究用質(zhì)量相同，其批量一般不少于1000人份，并能滿足臨床試驗對疫苗數(shù)量的要求；

　?。ㄈ┻M行臨床試驗的疫苗和對照品必須由中國藥品生物制品檢定所進行質(zhì)量復(fù)核；

　?。ㄋ模衿诤廷蚱谂R床試驗后，可以根據(jù)結(jié)果對生產(chǎn)工藝、質(zhì)量指標(biāo)等進行調(diào)整；Ⅲ期臨床試驗用樣品的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量指標(biāo)及生產(chǎn)規(guī)模和場地，原則上應(yīng)與疫苗批準(zhǔn)上市后的一致。